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γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB診斷結(jié)核感染臨床應(yīng)用
結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO估計(jì), 全球有約20 億人感染結(jié)核分枝桿菌,每年有約200萬人死于結(jié)核。我國是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一, 結(jié)核感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的2倍以上。結(jié)核病的臨床表現(xiàn)多樣, 可以累積全身各個(gè)系統(tǒng), 尤其是肺外結(jié)核病變往往十分隱匿, 給臨床診斷帶來極大的困難。結(jié)核菌素皮試(tuberculin skin test, TST)是長期以來用以快速診斷結(jié)核感染的唯一手段。然而TST 存在諸多缺陷: 在易受結(jié)核感染的免疫力低下人群中, 其敏感性反而大大降低; 結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified prote in derivatives, PPD)是200多種蛋白的混合物, 其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗(Bacillus Calmette-Gurin, BCG)的共同抗原成分, 在普遍接種BCG 的地區(qū)造成非常高的“假陽性”率。此外, 皮試的操作和結(jié)果的解釋存在主觀依賴性, 降低了檢查的準(zhǔn)確性。T-SPOT.TB 是以特異性抗原為刺激源, 應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzym e-linked mimunospot assay,ELISPOT)診斷結(jié)核感染的新方法。
結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答根據(jù)結(jié)核感染的狀態(tài), 人群可以分為無結(jié)核感染、活動性結(jié)核、潛伏性結(jié)核和治愈。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌, 侵入機(jī)體后, 首先引起固有免疫反應(yīng), 被巨噬細(xì)胞吞噬。在大多數(shù)感染者中, 單純的固有免疫并不足以抑制結(jié)核分枝桿菌的生長增殖。被感染的巨噬細(xì)胞凋亡后, 釋放出大量特異性抗原,可被樹突狀細(xì)胞加工呈遞給特異性的CD4、CD8和CDT 細(xì)胞, 以及CD1限制性T 細(xì)胞, 繼而引發(fā)獲得性免疫。CD4 T 細(xì)胞在結(jié)核免疫防御機(jī)制中發(fā)揮主要作用, 特異性的CD4 T 細(xì)胞與抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體2類分子復(fù)合物結(jié)合后被激活, 分泌C干擾素, 從而激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗結(jié)核活性。特異性CD8 T 細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)因子腫瘤壞死因子A和干擾素C并釋放顆粒酶和穿孔素溶解感染細(xì)胞, 同時(shí)啟動Fas途徑發(fā)揮其溶細(xì)胞作用。γ干擾素是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞因子。在大多數(shù)免疫力正常的感染者中, 獲得性免疫能夠控制卻不足以清除結(jié)核感染, 吞噬了結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞被纖維包裹形成肉芽腫而使感染局限, 這時(shí)機(jī)體呈現(xiàn)一種無癥狀的潛伏性感染狀態(tài), 而結(jié)核特異性的中央型記憶細(xì)胞(CCR7+CD27+)和效應(yīng)型記憶細(xì)胞(CCR7-CD27-)在機(jī)體中長期存在。潛伏性結(jié)核感染者一生中有10% 的可能發(fā)生結(jié)核病, 約5% 在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)表現(xiàn)為活動性結(jié)核,另有5% 將在此后的時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)。由于潛伏感染者的體內(nèi)長時(shí)間存留活菌, 當(dāng)出現(xiàn)各種原因?qū)е聶C(jī)體的免疫力低下時(shí),結(jié)核復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,如結(jié)核合并人免疫缺陷病毒(human mimunodeficiency virus,HIV)感染時(shí), 發(fā)展為活動性結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)將增加至每年10%。
T-SPOT.TB的原理及結(jié)果判斷
T-SPOT.TB是以ELISPOT 技術(shù)檢測結(jié)核感染的新方法, ELISPOT 技術(shù)是近20年發(fā)展起來的檢測抗原特異性T細(xì)胞的技術(shù), 是目前最敏感的檢測抗原特異性T細(xì)胞的方法之一, 可以檢測出1 /100 000~1 /50 000外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中經(jīng)某種抗原刺激后釋放某種細(xì)胞因子的細(xì)胞, 經(jīng)過酶聯(lián)顯色后, 通過ELISPOT分析系統(tǒng)(ELISPOT Reader)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù),1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞, 從而計(jì)算出抗原特異性細(xì)胞的頻率。T-SPOT.TB 的產(chǎn)生得益于基因分子生物學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)展。1999年, Behr等應(yīng)用基因芯片技術(shù)將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和BCG的全基因組進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示129個(gè)只特定存在于結(jié)核分枝桿菌而在BCG中缺失的開放讀碼框, 這些在BCG中缺失的部分被劃分為16個(gè)區(qū)域, 命名為RD1 ~RD16, 其
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